前言

过去二十年间，单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）的出现彻底改变了结构生物学领域，使得许多难以结晶的大分子复合物的结构解析成为可能，然而，对于分子量小于50 kDa的小蛋白质，其结构解析仍然面临挑战。理论计算表明，冷冻电镜尺寸极限大约在38 kDa左右。

小蛋白结构解析棘手的根本原因在于，小颗粒在图像中的信噪比极低，难以从传统重建方法中获得清晰的初始结构模型。而没有这个初始模型，就无法可靠地确定数十万甚至数百万个颗粒的朝向，进而无法进行高分辨率的三维重构。

针对这一问题的现有方案存在不足：

1. 使用标记物（fiducials）：通过结合刚性分子来增加有效质量。但费时费力，具有靶点特异性，结合物可能会遮挡蛋白功能区域 ；

2. 改进探测器：理论上可以提升信噪比，但目前仍处于研发阶段；

3. 新计算方法：有研究提出基于数据驱动正则化策略（BLUSH）的方法优化低质量初始图谱，但仍需进一步补充更高效的计算方案。

近日，哥伦比亚大学的 Oliver B. Clarke 教授团队提出了一种新方案，他们基于 CryoSPARC 软件，开发出高分辨率异质性从头重建（HR-HAIR）工作流程，直接突破了小分子量蛋白质冷冻电镜解析的技术瓶颈，研究成功解析了三个此前极难处理的、分子量在29-39 kDa的小蛋白结构。该研究以“High-resolution ab initio reconstruction enables cryo-EM structure determination of small particles”为题发表在《 bioRxiv》上。

研究内容

1. 核心方法：HR-HAIR

HR-HAIR的核心思想是绕过不可靠的低分辨率信息，直接利用高分辨率信号来指导颗粒的初始朝向确定。具体设计如下：

· 使用高分辨率数据：在 CryoSPARC 软件的异质性从头重建步骤中，仅使用高空间频率窗口数据例如5 Å到2.3 Å）；

· 迭代参数优化：采用极小的傅里叶半径步长（分辨率步长）进行迭代，确保获得正确结构模型；

图S1. iPKAc图像处理方案

2. 实验验证：多类小颗粒结构解析

研究团队使用HR-HAIR方法，成功解析了3个有代表性的小颗粒结构。

1）iPKAc（39kDa）：解析分辨率达到2.7 Å，图谱质量足够高，可以清晰地分辨出有序的ATP和镁离子。

图1. 用HR-HAIR解析iPKAc结构

2）血红蛋白α-β二聚体（29.4kDa）：解析分辨率达到4 Å，图谱具有清晰的二级结构特征、血红素和大侧链。

图2. 用HR-HAIR解析血红蛋白二聚体结构

3）Aca2-RNA复合物（37kDa）：解析分辨率达到3.0 Å，图谱可以直接从未经分类的颗粒堆栈中获得，且在局部精修后分辨率达到2.8 Å。

图3. 用HR-HAIR解析Aca2-RNA复合物结构

4）探索性尝试：钙调蛋白 (16 kDa)

研究还尝试解析16kDa的钙调蛋白，虽仅观察到结构域水平特征（未达二级结构分辨率），但证明了突破 20 kDa 以下的可能性。 

图4. 通过冷冻电镜观察到小鱼20kDa蛋白质的结构域水平特征

总结和展望

本研究开发了一种名为HR-HAIR的创新性冷冻电镜图像处理流程。该方法通过巧妙调整现有软件中的参数，仅使用高空间频率的数据进行从头算重建，从而成功绕过了小颗粒结构解析中最棘手的初始模型难题。

这项工作有力地突破了冷冻电镜的尺寸限制，将技术边界推向30 kDa以下。这不仅为解析大量关键的小分子量蛋白（如激酶、药物靶点）提供了一种强大且通用的纯计算解决方案，更为结构生物学研究开辟了新的可能性，在药物设计和疾病机制研究中具有重要的应用前景。